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RetroBeads Gamma Lumafuor操作說明

更新時間:2025-02-06      點擊次數(shù):512
RetroBeads Gamma Lumafuor操作說明


1、包裝和稀釋:


將Lumafuor的珠粒包裝在密封的小瓶中,并將濃縮的珠粒懸浮在蒸餾水中。如果用紅色珠子作為神經(jīng)通路的反向示蹤,推薦采用稀釋法:在不降低珠子熒光標記強度和質(zhì)量的情況下,可在大鼠視皮層使用1:4稀釋。但對于第一次實驗,我們不建議使用稀釋的珠子,而是使用原液進行注射示蹤。除了蒸餾水,常規(guī)的鹽溶液如氯化鈉和KCl也可以用作稀釋劑。如果使用綠珠,強烈建議使用未經(jīng)稀釋的原液。


2、存儲:


為了避免蒸發(fā),珠溶液應存放在4度冰箱中。不要冷凍它!凍豆會沒用,不能用。干燥后的珠子也不能使用(不能重新懸浮),產(chǎn)品沒有明顯的使用壽命。如果按要求儲存,可以儲存幾年。


3、注射:


珠子最好使用壓力注射,如1ml漢密爾頓微量注射器或氣動注射系統(tǒng)。如需小面積微量注射(30-50nl),可采用末端直徑30-50um的玻璃電極進行注射,直徑較大的玻璃電極可用于常規(guī)反向示蹤(注射體積0.1-0.3ul)。然而,即使在較高的劑量下,珠子也不會從注射部位顯著擴散(通常小于1 mm)。因此,為了盡可能完整地標記投射到更大核的神經(jīng)元,需要多點注射。盡管磁珠帶負電荷,但不建議使用離子滲透法來示蹤磁珠。


4、存活時間:


在大多數(shù)恒溫脊椎動物系統(tǒng)中,檢測珠子的最短有效時間是24小時。在48小時內(nèi),標記強度隨注射時間增加,48小時后熒光強度保持不變。在冷血動物中,檢測珠子的推薦時間是1周。目前還沒有檢測到珠子最長的可檢測周期。然而,珠的熒光強度和質(zhì)量可以在體內(nèi)保持至少14個月不變,并且細胞可以被標記。在動物或神經(jīng)元中沒有發(fā)現(xiàn)珠子的毒性作用。


5、固定和處理:


標準的固定方法是:0.1mpbs洗滌或灌注,固定在4%多聚甲醛中(0.1mpbs制劑,pH7.4)。用戊二醛固定會產(chǎn)生大量的組織自體熒光,會阻礙用珠子標記的神經(jīng)元。而且在戊二醛固定組織中不會觀察到綠珠,應盡量避免。如果使用冰凍切片,切片應該用PBS沖洗,并用明膠包被的載玻片干燥。風干后,載玻片應在二甲苯中保持透明1分鐘,然后用fluoromount或krystalon密封。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp .,F(xiàn)armingdale,NY獲得;Krystalon來自新澤西州吉布森鎮(zhèn)的Harleco (EM Industries)。


觀察:


紅珠里的染料是羅丹明,所以所有和羅丹明搭配的熒光濾鏡都可以。尼康公司的一些老款羅丹明濾鏡,由于背景較高,可能無法觀察到熒光珠。一般蔡司和萊茨的標準羅丹明濾鏡都能獲得較好的觀察效果。綠色熒光濾光片大部分都能很好的觀察到四季豆的熒光結果。設置為熒光黃的濾鏡可以獲得很強的明亮熒光,但也帶來了很高的背景干擾。結果表明,寬波段的熒光濾光片比窄帶濾光片能獲得更強的熒光信號。經(jīng)過長時間的觀察和拍照,珠子的熒光沒有



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