概述 - 定量“實時"PCR 或 qPCR

定量實時 PCR 改變了我們測量核酸濃度的能力，并且是驗證微陣列分析和其他基因組技術生成的表達數據的重要一步。實時 qPCR 儀器的開發(fā)促進了這一點，該儀器可測量反應每個步驟或“實時"產生的 qPCR 產物的量。 SYBR green 因其相對簡單和可靠而成為目前流行的實時 PCR 方法。在實時 PCR 技術發(fā)展之前，定量測量需要設置多個 PCR 反應，以便在擴增的線性階段捕獲 qPCR 產物。然后通過凝膠電泳或 HPLC 進行 PCR 產物的分離和定量。這些實驗非常費力，并且實現(xiàn)正確定量所需的操作次數增加了引入錯誤的可能性。因此，能夠在每個熱循環(huán)測量 PCR 產物的實時 PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。實時 PCR 儀器的開發(fā)可以在每個熱循環(huán)中測量 PCR 產物，從而提高了定量 PCR 的簡便性、準確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。實時 PCR 儀器的開發(fā)可以在每個熱循環(huán)中測量 PCR 產物，從而提高了定量 PCR 的簡便性、準確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。

一般來說，實時 PCR 方案與標準 PCR 反應類似。同樣的問題也適用于生產干凈的模板、設計引物和優(yōu)化反應條件。主要區(qū)別在于加入了 SYBR green 等嵌入劑或使用熒光引物來檢測 PCR 產物。在典型的反應中，qPCR 產物的產生呈指數級增長。由于需要幾個循環(huán)才能輕松檢測到足夠的產物，因此熒光與循環(huán)數的圖呈現(xiàn) S 形外觀。在稍后的循環(huán)中，反應底物耗盡，qPCR 產物不再加倍，并且曲線開始變平。曲線上熒光量開始快速增加的點，通常比基線高幾個標準差，稱為閾值循環(huán)（Ct 值）。 Ct 與模板的關系圖是線性的，因此比較多個反應之間的 Ct 值可以計算出目標核酸的濃度。這條線的斜率提供了 qPCR 效率的衡量標準。

PCR產物可通過生成標準曲線來定量或相對于對照基因進行定量?；跇藴是€的實時PCR定量可以利用質粒DNA或其他形式的DNA，其中每個標準的絕對濃度是已知的。然而，必須確保標準品的 PCR 效率與“未知"樣品的 PCR 效率相同。在某些情況下，從純化的靶標中進行 PCR 比用復雜的核酸混合物觀察到的效率更高。相對定量方法稍微簡單一些，因為它需要測量管家或對照基因以使目標基因的表達標準化。然而，選擇適當的控制基因可能會引起問題，因為它們不一定在所有未知樣本中均等表達。這可以通過對一組管家基因進行標準化測量來避免，以避免這種變異性問題。

進行實時 PCR 的一個關鍵方面是從高純度的模板開始。在處理某些生物樣品時，這可能具有挑戰(zhàn)性。幸運的是，已經開發(fā)了許多商業(yè)產品來促進高純度核酸的分離。去除污染性苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對于基因表達研究，必須使用高純度試劑并多次重復進行逆轉錄，因為此步驟可能會引入模板復制的變異性。逆轉錄可以在實時PCR之前進行，或者可以并入擴增程序中。

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