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如何選擇合適的二抗?

更新時(shí)間:2025-04-16      點(diǎn)擊次數(shù):63

二抗用于多種免疫測定中,以檢測一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料偶聯(lián),以便檢測一抗。與一抗不同,二抗針對(duì)一抗的物種和同種型產(chǎn)生,并通過在多個(gè)位點(diǎn)與一抗結(jié)合來檢測一抗。

要成功選擇二抗,應(yīng)考慮以下因素:

確保良好匹配 – 宿主物種是產(chǎn)生二抗的動(dòng)物,應(yīng)始終與一抗的宿主不同。例如,如果您使用在兔子中產(chǎn)生的一抗,您將需要在兔子以外的其他物種(如山羊、驢或小鼠)中產(chǎn)生的抗兔二抗(圖 1)。

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圖 1:二抗機(jī)制。

完整的抗體還是片段? – 實(shí)際上,真正的問題是“您的一抗是單克隆還是多克???這兩個(gè)問題的答案通常取決于應(yīng)用程序。單克隆一抗包含免疫球蛋白的單一同種型。因此,使用特異性識(shí)別該同種型的二抗至關(guān)重要。此外,單克隆抗體通常在小鼠、兔子和大鼠中產(chǎn)生。因此,如果一抗是小鼠 IgG1,您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG??贵w片段適合免疫組化和免疫熒光,因?yàn)樗鼈凅w積較小且能夠穿透組織。然而,較小的尺寸可能會(huì)限制與片段偶聯(lián)的染料或酶的選擇,從而導(dǎo)致二抗的靈敏度可能不如全抗體選擇。

多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的幾種同種型的混合物。因此,為了最大限度地檢測靶標(biāo),最好使用可識(shí)別所有同種型的二抗。多克隆抗體通常在兔、山羊、綿羊和驢中以全抗體形式(重鏈 + 輕鏈)飼養(yǎng),因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對(duì)二級(jí)宿主物種進(jìn)行免疫,從而使純化的二抗能夠識(shí)別所有形式。例如,如果一抗多克隆抗體是山羊 IgG,則需要抗山羊 IgG (H+L)。然而,全抗體會(huì)導(dǎo)致高背景和低特異性,因?yàn)檩p鏈由所有免疫球蛋白共享,這會(huì)增加交叉反應(yīng)性(圖 2)。

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圖 2:免疫測定中全 IgG 二抗與片段化二抗的結(jié)合機(jī)制。

根據(jù)您的應(yīng)用選擇偶聯(lián)物 - 這取決于二抗如何檢測信號(hào)。例如,免疫組織化學(xué)、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用使用基于生物素標(biāo)記的比色和化學(xué)發(fā)光檢測來放大信號(hào)并提高靈敏度,以及與辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 起作用的酶促反應(yīng)。然而,對(duì)于免疫標(biāo)記、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn),使用熒光染料(如 Alexa Fluor)檢測信號(hào),這些染料直接與抗體偶聯(lián)以放大信號(hào)和靈敏度。

親和純化抗體與交叉吸附抗體 – 此步驟用于提高抗體的特異性,并且可以在親和純化和交叉吸附方面進(jìn)行區(qū)分。大多數(shù)二抗通過親和層析進(jìn)行純化,從而產(chǎn)生高親和力抗體。這種抗體通常用于 IHC,因?yàn)樗鼈兲峁┳钚〉姆翘禺愋越Y(jié)合,也可用于 western blot 以檢測低豐度蛋白質(zhì)。交叉吸附的二抗通常會(huì)經(jīng)過額外的純化步驟,以過濾掉與脫靶免疫球蛋白種類結(jié)合的成員。此步驟增加了它們的特異性并降低了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學(xué)等特定應(yīng)用而設(shè)計(jì)。

總之,二抗的選擇取決于手頭的應(yīng)用、靶標(biāo)豐度所需的靈敏度和純化水平,以及非特異性結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。如果您想討論上述方法,歡迎隨時(shí)聯(lián)系!


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